Hodnocení účinnosti hygienizace technologií zpracovávajících bioodpady

5.2.4.2

Hodnocení účinnosti hygienizace technologií zpracovávajících bioodpady

Ing. Bohumil Beneš a kolektiv autorů

1 VALIDACE ÚČINNOSTI HYGIENIZACE BIOTECHNOLOGICKÝCH, TEPELNÝCH A CHEMICKÝCH PROCESŮ VEGETATIVNÍMI BUŇKAMI
1.1 Úvod

Schopnost procesu minimalizovat rizika způsobená patogeny v surovinách nemůže být hodnocena jenom analýzou přítomnosti nebo absence indikátorových organismů (bakterií, virů, plísní a hub nebo parazitů) v konečném produktu. Nepřítomnost jednoho nebo všech zmíněných indikátorů ve finálním produktu může být způsobena několika důvody. Nemusejí být přítomny v surovině nebo mohou být přítomny v surovině, ale v nízkém počtu (méně než 5 log). Dalším důvodem je, že neexistují dostatečně obohacující postupy pro metody reizolace cílového indikátorového organismu ve vyšetřované matrici (zkoncentrování, např. bakterie) nebo neexistuje technicky možná kvantitativní izolace indikátorového organismu vzhledem k vlivu složité matrice (např. viry).

V případě, že samotný proces zabezpečí inaktivaci patogenů, které reprezentují indikovanou úroveň chemo nebo termorezistence, jsou reprezentativní indikátorové organismy exponovány ve stejné matrici, jako je zpracovávaná matrice v testované technologii v uzavřeném testovacím systému (TCS) validovaným pokusem. Zároveň se zaznamenávají příslušné parametry procesu během expozice pro definování technických podmínek, které musejí být dodrženy pro bezpečnou inaktivaci. Na základě výsledků pokusu přežívání vneseného indikátorového organismu je možné definovat kritické kontrolních body v aplikaci systému HACCP.

UPOZORNĚNÍ - Odpady a vzorky kalu mohou obsahovat nebezpečné a hořlavé látky. Mohou obsahovat patogeny a podléhat biologické aktivitě. Proto se doporučuje, aby se s těmito vzorky zacházelo se zvláštní péčí. Plyny, které mohou být produkovány mikrobiální činností, jsou potenciálně hořlavé a mohou způsobit přetlak v uzavřených lahvích. Explodující lahve by pravděpodobně mohly způsobit uvolnění infekčních částic z explodujícího objektu a/nebo uvolnění patogenních aerosolů. Pokud je to možné, je třeba se vyhnout používání skleněných lahví. Vzhledem k mikrobiologickému riziku spojenému s touto metodou by měly být dodržovány předpisy pro bezpečnou práci v mikrobiologické laboratoři.

 Nahoru1.2 Předmět a vymezení působnosti

Tato část postupu popisuje metodu validace účinnosti hygienizace biotechnologických, termálních a chemických procesů pro zpracování vedlejších živočišných produktů, kalu z čistíren odpadních vod a bioodpadů, u kterých se předpokládá, že zajistí hygienickou nezávadnost výstupů z uvažovaných technologií (hnojiv, kompostů, digestátů nebo srovnatelných produktů) vegetativními formami bakterií.

Popisovaná metoda je vhodná pro stanovení účinnosti hygienizace biotechnologických, termálních a chemických procesů zpracování (CEN/TC 308 - doc. 525 (REVIZE Směrnice 86/278/EEC - 3. návrh (1) a Nařízení (ES) č. 208/2006 (2) pro eliminaci patogenů v neupravených substrátech. Procesy zpracování jsou validovány snížením o právním předpisem definovaný počet řádů počtu testovacích mikroorganismů jako např. Salmonella Senftenberg 775W, H₂S negativní a Enterococcus faecalis nebo Escherichia coli. Pokud není stanoveno právním předpisem jinak, obvykle musí být použita Salmonella Senftenberg 775W, H₂S negativní pro validaci aerobních termofilních procesů jako kompostování a chemické procesy, zatímco převážně termofilní anaerobní procesy a fyzikální procesy musejí být validovány s Enterococcus faecalis.

Poznámka: Vyhláška č. 341/2008 Sb., o podrobnostech nakládání s bioodpady, vyžaduje pro validaci účinnosti hygienizace jako vnesený indikátorový organismus bakterie Salmonella senftenberg W 775 (H₂S negativní) a nebo Escherichia coli.

 Nahoru1.3 Normativní odkazy

Definice

Pro účely této evropské normy platí následující termíny a definice.

Enterokoky

Enterokoky jsou skupinou grampozitivních, kataláza negativních, fakultativně anaerobních bakterií, které rostou v krátkých řetězcích.

Metoda pro stanovení enterokoků

Princip metody je popsán , kapitole 2.2 tohoto návodu

Escherichia coli

Escherichia coli patří do čeledi Enterobacteriaceae, je gramnegativní, nesporulující, tyčinkovitá bakterie, laktóza pozitivní a je schopná růst při 44 °C. Většina kmenů E. coli je schopna produkovat indol z tryptofanu a je V-glukoronidáza pozitivní

Metoda pro stanovení Escherichia coli

Princip metody stanovení je popsán , kapitole 2.1 tohoto návodu

Somatické kolifágy

Somatické kolifágy jsou bakteriofágy, které sestávají z kapsidu obsahujícího DNA jako genom.

Metoda pro stanovení bakteriofágů

Princip této metody je popsán v Dokumentu CEN BT/TF 151 (Extraction of bacteriophages from sludge, soils and treated biowaste).

Vegetativní bakterie

Bakterie, které jsou schopny normálního růstu v bujonu nebo na agaru bez resuscitace předkultivací.

KTJ - kolonie tvořící jednotka

Růst jednotlivých bakteriálních buněk do viditelných kolonií na agarovém médiu, včetně na membránových filtrech na agarovém médiu.

PFU, plaky tvořící jednotky

Plaky tvořící jednotka je mírou počtu částic schopných tvořit plaky na jednotku objemu.

Spikování

Umělá kontaminace matrice, která má být exponována v procesu, definovaným množstvím bakteriální suspenze testovacího kmene.

Matrice

Matrice je reprezentativní vzorek materiálu, považovaného za zpracovaný, který je spikován testovacím kmenem, pro vyhodnocení vlivu chemických, fyzikálních a biologických vlastností matrice na inaktivaci exponovaných bakterií.

Biotechnologický proces

Proces charakterizovaný především aktivitou organismů (např. mikroorganismů) za definovaných podmínek, pro zamýšlený účel (např. kompostování).

Tepelný proces

Proces charakterizovaný především přidáním energie ve formě tepla za definovaných podmínek, pro zamýšlený účel (např. pasterizace).

Chemické procesy

Proces charakterizovaný především přidáním určitého množství chemikálií (např. vápna) k matrici, za definovaných podmínek, pro zamýšlený účel (např. dezinfekci).

Inaktivace mikroorganismů

Redukce mikroorganismů během biochemických, tepelných a chemických procesů.

Citované a související normativní předpisy

Jsou uvedeny , kapitole 1.3.

 Nahoru1.4 Symboly a zkratky

SNA: Standardní živný agar I

SNB: Standardní živná půda I

TCS 1: testovací uzavřený systém typ 1

TCS 2: testovací uzavřený systém typ 2

NK : neupravená kontrola

 Nahoru1.5 Princip validačního procesu

Proces pro validaci různých procesů s využitím vhodného testovacího uzavřeného systému (TCS) vyžaduje následující kroky:

1. Příprava definované suspenze bakteriálního testovacího kmene v laboratoři

2. Stanovení počátečního počtu bakterií v připravené suspenzi

3. Příprava substrátu, který má být použit jako matrice

4. Příprava testovacího uzavřeného systému

5. Vložení definovaného objemu matrice do TCS a spikování určitého množství testovacích bakterií (TCS 1) nebo spikování definovaného objemu matrice určitým množstvím testovacích bakterií a naplnění TCS kontaminovaným materiálem (TCS 2)

6. Expozice TCS procesu na definovaných místech vhodným způsobem pro zamýšlenou dobu expozice

7. Odebrání TCS a stanovení reziduálního počtu bakterií v exponované matrici

8. Stanovení stupně inaktivace

1.6 Činidla, zřeďovací roztoky a kultivační média

K zajištění reprodukovatelných výsledků se pro přípravu kultivačních médií a zřeďovacích roztoků používají buď složky definované kvality a chemikálie zaručené analytické kvality, nebo dehydratované zřeďovací roztoky, nebo kompletní média připravená podle pokynů výrobce. Připravují se podle účelu z demineralizované nebo destilované vody, která neobsahuje látky, které mohou za testovacích podmínek inhibovat růst [ISO 8199].

 NahoruSložení

Standardní živný agar I (SNA) (pH 7 ± 0,2)

 NahoruPříprava

Jednotlivé složky se rozpustí za promíchávání. Pokud je třeba, upraví se hodnota pH roztoku na 7±0,2 kyselinou chlorovodíkovou (1 mol/l) nebo roztokem hydroxidu sodného (1 mol/l). Médium se sterilizuje v autoklávu při teplotě 121 ± (–1 až +3) °C po dobu 15 min a plní do kultivačních misek.

 NahoruSložení

Standardní živná půda I (SNB) (pH 7 ± 0,2)

 NahoruPříprava

Jednotlivé složky se rozpustí za promíchávání. Pokud je třeba, upraví se hodnota pH roztoku na 7±0,2 kyselinou chlorovodíkovou (1 mol/l) nebo roztokem hydroxidu sodného (1 mol/l). Médium se sterilizuje v autoklávu při teplotě 121 ± (-1až +3)°C po dobu 15 min a plní se po 9 ml do zkumavek.

 NahoruSložení

Roztok NaCl (0,9 % w/v)

Chlorid sodný se rozpustí v baňce o objemu 2 000 ml s plochým dnem. Hodnota pH se upraví na 7±0,2 při teplotě 25 °C. Plní se po 9 ml do kultivačních zkumavek. Sterilizuje se v autoklávu při 121 ± (–1 až +3) °C po dobu 15 min.

 Nahoru1.7 Přístroje

S výjimkou komerčně dodávaného sterilního skla musí být skleněné nádobí a pomůcky sterilizovány podle pokynů daných v ISO 8199.

Obvyklé vybavení mikrobiologické laboratoře a zejména:

• Širokohrdlé skleněné lahve nebo kádinky, např. 125 ml, 200 ml, 500 ml a 2 000 ml.

• Termostat vytemperovaný na teplotu 36 ± 2 °C (s integrovanou třepačkou, s krouživým pohybem a statický) a na teplotu 70 ± 1 °C (statický).

• Autokláv (parní sterilizátor).

• Lednice.

• Sterilní plastové kultivační misky, s víčkem asi 90 mm v průměru.

• Sterilní dělené pipety, s nominálním objemem 1 a 10 ml.

• Očkovací klička (např. platino-iridiový drát), o průměru asi 3 mm.

• Zařízení pro třepání kultivačních zkumavek nebo baněk.

• Kultivační zkumavky, o objemu 25 ml nebo ekvivalentní nádoby.

• Vortex mixer vhodný pro kultivační zkumavky o objemu 25 ml nebo ekvivalentní nádoby.

• Laboratorní lžička.

• pH metr, s tepelnou kompenzací a měřicí elektrodou.

• Nastavitelná mikropipeta až na objem 200 μl.

• Vodní lázeň.

• Analytické váhy.

• Sterilní plastová láhev, např. 125 ml, 200 ml a 500 ml.

• Kontejner autoklávovatelný.

• Centrifuga.

 Nahoru1.8 Pracovní postup

Příprava definované suspenze bakteriálního testovacího kmene v laboratoři

Pro přípravu definované suspenze bakteriálního testovacího kmene se použijí následující lyofilizované referenční materiály:

Salmonella Senftenberg H₂S negativní

nebo/a

Escherichia coli

nebo/a

Enterococcus faecalis

Příprava definované bakteriální suspenze vyžaduje následující tři kroky:

1. Příprava rekonstitučního roztoku:
   Referenční materiál se suspenduje v 9 ml standardní živné půdy I Inkubuje se při 36 ± 2 °C po dobu 22 ± 2 hod v temnu, s nebo bez třepání.

2. Příprava čisté kultury (zásobní kultury) inokulací pevného média:
   Nabere se plná klička (10 μl) kultury (dle bodu 1) a zaočkuje se standardní živný agar I. Inkubuje se v temnu při 36 °C ± 2 °C) po dobu 22 ± 2 hod. Po inkubaci může být kultura na agaru uchovávána při 4 °C po dobu až 7 dnů.

3. Příprava finální bakteriální suspenze (spikovací suspenze):
   Kličkou se asepticky přenese pět kolonií ze standardního živného agaru I přímo do 500 ml standardní živné půdy I. Inkubuje se při 36 °C ± 2 °C po dobu 22 ± 2 hod v temnu, s nebo bez třepání.

Tato bakteriální suspenze (spikovací suspenze) se použije pro umělou kontaminaci matrice v testovacím uzavřeném systému typu 1 a typu 2.

Stanovení počátečního počtu bakterií v připravené suspenzi

Princip:

1. Vezme se alikvotní část (1 ml) čerstvě připravené finální spikovací suspenze. Připraví se sada ředění 1:10 - 1 ml spikovací suspenze + 9 ml sterilního roztoku NaCl - až do ředění 10^–7.

2. Po promíchání se přenese 0,1 ml z posledních tří ředění (10^–5, 10^–6 a 10^–7) vždy na dvě plotny se standardním živným agarem I.

3. Na všech plotnách se po povrchu agaru rozetře inokulum s použitím sterilní laboratorní lžičky otáčením plotny rukou nebo na otočné desce.

4. Inkubuje se při 36 °C ± 2 °C po dobu 20 ± 2 hod.

5. Spočítá se počet vyrostlých kolonií na každé agarové plotně. Ideální počet vyrostlých kolonií se pohybuje mezi 30 až 300 koloniemi na jedné plotně. Pokud počet kolonií přesáhne horní mez, připraví se další ředění 10^–8 a 10^–9 a přenese 0,1 ml z obou ředění na dvě plotny se standardním živným agarem I.

6. Spikovací suspenze a všechna ředění se uchovávají při 4 ± 2 °C až do doby, kdy se stanoví konečný počet kolonií na příslušných agarových plotnách.

Koncentrace bakterií (KTJ/ml) se vypočítá v neředěné spikovací suspenzi podle následující rovnice:

kde:

KTJ: kolonie tvořící jednotky

N: počet ploten vzatých v úvahu pro ředění

C: součet KTJ spočítaných na plotnách vzatých v úvahu

d: zřeďovací faktor

v: objem vzorku (0,1 ml)

Příklad:

Počet KTJ v 1 ml suspenze = 1,12 × 10⁹

Příprava substrátu, který má být použit jako matrice

 NahoruVšeobecně

Vzorky mají tendenci fermentovat, zejména pokud nejsou upraveny a mohou obsahovat patogenní mikroorganismy. Je nezbytné udržovat vzorky i části vzorků odděleně od potravin a nápojů. Při přepravě a nakládání se vzorky je nezbytné, aby byla dodržována národní a mezinárodní nařízení vztahující se ke vzorkům, které obsahují infekční agens.

Dodržování čistoty při práci je nezbytné. Při zacházení se vzorky je nutné mít rukavice, chránit oči a obličej. Zároveň je nutné chránit ochranným oděvem celé tělo a hlavu bezpečnostním štítem. Je třeba zamezit poranění, ke kterému by mohlo dojít explozí vzorkovnic. Plyn, který může vznikat dodatečnou fermentací matric vzorků, je obvykle hořlavý, takže veškeré zařízení v okolí musí být nehořlavé, aby nebyl zdrojem požáru.

Viz také UPOZORNĚNÍ v úvodu.

Substrát pro bioplynové stanice a pasterizaãní jednotky

Princip:

1. Odebere se asi 1 l určené matrice (vstupní suroviny nebo jejich směsi) do plastové lahve

2. Sterilizuje se v autoklávu při 121 ± 3 °C po dobu 15 ± 2 min. k získání určené matrice bez bakterií, které se přidávají jako suspenze.

3. Po autoklávování se upraví hodnota pH na 6.5-7.0.

 NahoruSubstrát pro kompostování

Princip:

1. Odebere se tolik určené matrice, kolik je potřeba pro naplnění zamýšleného počtu TCS 2 (počítá se asi 300 g matrice na TCS 2) v kontejnerech nebo sterilních plastových sáčcích.

2. Po odběru určené matrice se matrice vloží do kovového kontejneru.

3. Sterilizuje se v autoklávu při 121 ± 3 °C po dobu 15 ± 2 min. k získání určené matrice bez bakterií, které se přidávají jako suspenze.

 NahoruPříprava testovacího uzavřeného systému

Testovací uzavřený systém typu 1 (TCS 1)

Tento typ uzavřeného systému se používá pro více nebo méně tekuté substráty, u kterých se předpokládá, že budou zpracovány v bioplynové stanici nebo pasterizační jednotce (např. hnůj, odpad ze stravování, kal z čistíren odpadních vod). Několik testovacích uzavřených systémů tohoto typu se může exponovat procesu, v závislosti na mechanických silách, které se očekávají na místě expozice, buď upevněné na tyči bez mechanické ochrany nebo ve vhodném ochranném zařízení.

 NahoruPopis

TCS 1 (viz obr. 1 v příloze A) sestává z dutého syntetického válce (polykarbonát) krytého na obou stranách semi-permeabilními polykarbonátovými membránami (velikost pórů 20 μm), které jsou upevněny dvěma těsnicími šroubovacími kroužky. Polykarbonátový membránový filtr umožňuje přístup rozpustných a plynných sloučenin ze substrátu k testovacím organismům bez kontaminace okolního prostředí. Je možné použít i jiný testovací uzavřený systém,…